Orchiblog

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mercredi 19 septembre 2012

Culture in vitro : bibliothèque (2)

Et encore un excellent ouvrage, récent, et en français. Incontournable.


jeudi 13 septembre 2012

Micropropagation : premiers vitro-plants

Après 3 mois de culture sur divers milieux voici les premiers essais donnant des résultats assez variables en fonction des espèces :
  • La vigne présente de nombreuses pousses obtenues à partir d'un bourgeon axillaire ; à noter les feuilles d'aspect juvénile suite au traitement hormonal
  • Le bégonia donne également de nombreux nouveaux plants à un stade moins avancé que la vigne
  • Les cals de ficus ne sont pas différenciés en feuilles

Pour des premiers tests avec des conditions d'expérimentation empiriques, le résultat est très satisfaisant.




Vitis vinifera (vigne) : multiples plants (J+100)

Begonia gracilis : multiples plants (J+100)

Ficus benjamina : cals (J+100)

jeudi 26 juillet 2012

Biologie végétale : bibliothèque

Un peu de complément de formation en biologie végétale :




vendredi 22 juin 2012

Micropropagation : Ficus benjamina (1)

Voici les premiers résultats très satisfaisants de culture in vitro de Ficus benjamina.

A venir les résultats sur Begonia gracilis.

Les tests sont en cours sur Saintpaulia ionanta, Begonia rex et Vitis vinifera (vigne).

Plant mère


Préparation aseptique des explants


Explants à J0


Cal à J +24


Feuille sur un cal sur à J +24

lundi 26 mars 2012

Culture in vitro : bibliothèque

En pleine lecture ...

Actuellement :



Lectures plus anciennes :



dimanche 18 mars 2012

Micro-propagation : 1ères multiplications de méristèmes ?

Après 3 semaines, on dirait bien ! A confirmer ...



Edition le 26/03/2012 : En fait il n'y a pas de divisions cellulaires ...
Conclusion : je vais me plonger dans la biblio pour déterminer un nouvel angle d'attaque de la micro-propagation

vendredi 24 février 2012

Micro-propagation : 1ers essais

Après la théorie, la pratique.

Le plus simple pour démarrer semble être de partir des yeux dormants des hampes florales de Phalaenopsis. Comme leur nom l'indique, ce sont des éléments de la plante qui sont en dormance sous l'effet de la dominance apicale des fleurs (action hormonale empêchant le développement des bourgeons). L'opération de micro-propagation va consister à lever la dormance en isolant ces cellules. Dans la nature c'est à partir de ces bourgeons que peuvent apparaître les keikis sur les Phalaenopsis.

2 Techniques :
  > Prélever un fragment de hampe florale où se trouve l'oeil dormant (voir photo ci-dessous) et planter l'explant dans du milieu de culture pour croissance in vitro. Les premiers essais ne sont pas concluants

  > Prélever l’œil dormant et le mettre en culture in vitro. Cette méthode est en cours d'évaluation ...

Résultats à suivre prochainement !

Hampes florales

Cellules en dormance mises en culture

samedi 28 janvier 2012

Micro-propagation / micro-bouturage : introduction

Un grand classique de la culture végétale in vitro est le micro-bouturage ou micro-propagation.
Comme son nom l'indique on fait de la multiplication végétative à partir de fragments d'un plant mère. On obtient ainsi des clones du parent.

Le principe est que, théoriquement, chaque cellule est totipotente, c'est-à-dire capable de devenir n'importe quel type de cellule différenciée au sein d'un organe : cellule de racine, tige, feuille, fleur, etc. Normal : toutes les cellules d'une plante possèdent intégralement le même patrimoine génétique (les mêmes chromosomes).
En fonction de nombreux facteurs internes (hormones, cellules proches, etc.) ou externe (température, lumière etc.), les gènes pourront ou non s'exprimer, conférant à la cellule un rôle dans l'organe où elle se trouve.

Voilà pour la théorie simplifiée à l'extrême (c'est peu de le dire !).

Dans la pratique, beaucoup de plantes, contrairement à la plupart des animaux, ont la capacité de voir leurs cellules spécialisées se dé-différencier pour se re-spécialiser différemment.

Par exemple en mettant quelques jours une branche de saule dans l'eau on voit des racines se former : certaines cellules de la tige se dé-différencient pour devenir des cellules de racines. Mais toutes les cellules du saule n'ont pas cette capacité du fait de l'inhibition plus ou moins importante de cette capacité de dé-différenciation.

Bonne nouvelle chez les orchidées : ce phénomène se produit également ! Chez le Phalaenopsis par exemple, il peut se produire naturellement : de nouveaux plants apparaissent sur les hampes florales. C'est ce qu'on appelle les keikis.

Ces quelques explications étant données, il ne reste plus qu'à passer à la pratique !

vendredi 2 décembre 2011

Suivi des semis : Phalaenopsis miniatures après 4 mois

Quelques photos montrant les plants de Phalaenopsis 4 mois après semis et repiquages : Déjà plusieurs feuilles et plusieurs racines.





jeudi 3 novembre 2011

Suivi des semis : les premières racines

Après l'apparition d'ébauches de feuilles à J+62 après le semis, voici les premières racines à J + 97 !


J + 75


J + 97




dimanche 25 septembre 2011

Semis : pourquoi les 1ers essais n'ont pas fonctionné

Alors que les 1ers tests il y a 2 mois n'ont donné aucun résultat, les semis en vert ont été une réussite.
Analyse des causes possibles des absences de germination :

1- Milieu de culture non adapté ?
     > Non : cf. le succès des semis en vert

2- Méthode de décontamination trop agressive ?
    > Non : un test de dilution de la solution de décontamination a permis de déterminer la concentration optimale avec la germination des graines à la clé

3- Durée de germination des graines important ?
     > Non : les graines de Phalaenopsis semées en vert ont germé après 3 semaines.

4- Problème de viabilité des graines ?
     > Oui : cf. succès des hybrides maison

Les graines, réputées fragiles, ont certainement pris un coup de chaud lors du transport ...




vendredi 26 août 2011

Semis en vert : 1ères germinations !

Suite aux premiers essais infructueux, je me suis lancé dans la technique dite de green seeding, ou semis en vert. Il s'agit de prélever les graines avant la fin de la maturation de la capsule.

Les avantages :
- La récolte peut se faire aux 2/3 de la durée totale de maturation du fruit
- Les graines étant enfermées dans la capsules, l'étape de décontamination avant semis est inutile

Un mois après le semis, les graines ont germé : de jaune-marron elles sont passé à vert et commencent à gonfler.
C'est donc une réussite ! Le milieu de culture étant le même que celui des 1ers essais infructueux, cela signifie que le problème se situait soit au niveau de la viabilité des graines, soit au niveau de la méthode de décontamination. Ces pistes seront explorées prochainement.

Quelques photos. La capsule prélevée provient du plant présenté ici.

Capsule de Phalaenopsis 112 jours après l'hybridation

Prélèvement du pollen (à gauche) et semis(à droite)

Début de germination à J+20

J+27

jeudi 4 août 2011

Incubateur version 2 : relooking

Depuis le bilan de l'incubateur in vitro version 1, le projet a été abordé sous un angle nouveau.

Version 1 : créer un incubateur avec l'électronique et le logiciel, puis s'en servir pour les cultures
> Cette démarche m'a permis d'essayer de résoudre la plupart des problématiques en terme de circuits, capteurs, logiciel

Version 2 :
Lancer les cultures et bâtir l'incubateur en fonction des besoins.
> Approche plus pragmatique

1ère conséquence : repenser les dimensions !!
En fait le premier incubateur est bien trop petit par rapport à la quantité de semis réalisée !!!
Finalement l'idée a été de réaliser un compromis entre ce qui avait été réalisé pour les tests d'hydroponie et le petit coffre de bois : un rayonnage d'étagère !



Serre hydroponique

Incubateur version 1



Incubateur version 2

dimanche 24 juillet 2011

Suivi des semis

Quelques nouvelles des semis :

- Le 16/07/2011 semis de Phalaenopsis (raptical x Mivagala) x (Aphrodite x Chamonix) semi alba de chez Vacherot. A ce jour, pas de germination
- Le 14/07/2011 semis de Vanda caerulea de chez B&T world seeds. Pas de germination non plus.

Les semis sont sous néon 18h / jour (photo ci-dessous)

Les raisons des non germinations peuvent être multiples :
- Graines non viables
- Graines périmées
- Méthode de décontamination trop agressive
- Milieu de culture non adapté
- Durée de germination variable en fonction des espèces

Depuis les semis des Vanda je teste différentes conditions afin de cerner la meilleure méthode de culture.

En attendant j'ai également des graines de Pleiones fuego grex à semer.
Une commande de 3 sortes de Dendrobium devraient arriver courant de l'été.
Et je reste à la recherche de nouveaux fournisseurs pour effectuer des semis régulièrement pour augmenter les chances de germination.

Tout ça en attendant la maturation de mes propres graines d'ici la fin 2011.


jeudi 16 juin 2011

Premiers semis d'orchidées

Les graines d'orchidées

D'abord un petit rappel sur la multiplication sexuée des orchidées.

Ces plantes ont la réputation d'être particulièrement complexes à cultiver, et ce n'est pas pour rien, car même l'obtention de graine et leur semis sont délicats.

La fécondation des fleurs se réalise à la main car, pour faire simple, les fleurs ne sont butinées dans la nature que par une catégorie particulière d'insecte (pardonnez le simplisme des explications et la généralisation outrancière, sachant qu'il existe des dizaines de milliers d'espèces d'orchidées !!!).

Une fois les fleurs fécondées, la maturation des fruits prend plusieurs mois.

Les fruits contiennent des millions de minuscules graines qui, contrairement aux graines de haricot, par exemple, ne contiennent pas les réserves nutritives indispensables à la germination et à la croissance du plant non encore autonome (pas de racine).
Ces substances nutritives sont apportées par un champignon vivant en symbiose avec ces jeunes plants d'orchidées.

In vitro, ce champignon peut être remplacé par un milieu nutritif synthétique : d'où la culture in vitro.

Choix pour la première culture

Pour se lancer dans les semis d'orchidées, 2 possibilités : collecter le maximum d'informations auprès de sources variées, et acquérir le matériel chez différents fournisseurs, ou bien acheter un kit de culture.
J'ai opté pour la seconde solution pour réduire les risques d'échec !

C'est chez Vacherot que j'ai fait l'acquisition de ce kit (Mérys). C'est très cher quand on voit ce qu'il contient : un peu de verrerie, une spatule, un scalpel etc. (on trouve tout ça pour trois fois rien chez les fournisseurs de matériel de laboratoire), très peu de milieu de culture, pas beaucoup plus de produit désinfectant, du substrat, des pots et des graines.

Bref, je suis satisfait de l'achat pour :
- Le milieu prêt à l'emploi
- Les graines
- La notice suffisamment claire

Les grandes lignes techniques

La préparation des milieux ne demande pas de grosses difficultés :
- Dissolution et coulage le milieu
- Stérilisation des flacons en cocotte minute

La stérilisation des graines avec l'hypochlorite de sodium est plus délicate :
- Dissolution des sels et filtration
- Mise en présence de la solution de désinfection et des graines
- Séparation des graines et de la solution : c'est le point délicat (voir ci-dessous)

L'ensemencement des milieux :
- Stérilisation du matériel de prélèvement
- Manipulation en conditions stériles sous la hotte "à flux laminaire" maison !!!!

La stérilisation des graines

La technique proposée par Mérys consiste à retourner le tube contenant les graines en suspension pour les laisser flotter et former un anneaux.
L'ouverture du bouchon tube retourné est sensée laisser échapper la solution mais pas les graines qui devraient restées collées aux parois.

Les problèmes sont multiples à cette étape :
- En fonction des espèces d'orchidées, les graines viables stérilisées flottent ou sédimentent !
- Les graines non viables font l'inverse
- Si la quantité de graines est insuffisante, et le diamètre du tube trop important, les graines ne se collent pas aux parois
- Pour les graines viables qui flottent, certains préconisent de laisser s'écouler le liquide doucement et d'autre rapidement

Dans mon cas, je n'ai pas pu récupérer beaucoup de graines. Grosse déception !

La solution : la centrifugation pour séparer la totalité des graines.


Le bilan

Cette première expérience a été très riche et a permis d'utiliser la hotte stérile.

L'incubateur n'est pas encore prêt pour accueillir les premiers semis, donc l'incubation se fera à température ambiante à la lumière du jour.

Le prochain matériel à fabriquer pour le bio fablab : une centrifugeuse !!
Lorsque ce matériel sera prêt, de nouveaux semis seront réalisés avec des graines, des milieux et de la verrerie provenant de différents fournisseurs.


Kit in vitro Mérys (1)

Kit in vitro Mérys (2)

Matériel de culture

Manipulations sous hotte

dimanche 24 octobre 2010

Incubateur thermostaté : premiers essais

Qui dit culture in vitro, dit incubation des vitro-plants.
Voici le plan et une première réalisation de l'incubateur thermostaté.

Température

Sur le côté gauche, un module Peltier est inséré en sandwitch entre 2 radiateurs.
En fonction de la polarité, le module fournira du chaud ou du froid.

Les premiers tests sommaires permettent l'obtention des températures suivantes :
  • Minimum : 16,3°C
  • Maximum : 27,6°C
La température extérieure était de 20,5°C.

Lumière

Les 4 néons assurent l'éclairage.

Régulation

Les 2 paramètres température / lumière vont être pilotés par ordinateur avec un module Arduino.
Quand la régulation de température aura été entièrement étudiée, l'aération sera ajoutée.








mercredi 2 juin 2010

Plan de travail : la paillasse

Qui dit expérimentation, dit plan de travail.

Avec l'objectif de me lancer dans des cultures in vitro, il faut un plan de travail facilement lessivable, et solide.

Côté réalisation de circuits électroniques, j'ai cruellement manqué d'un bon espace de travail jusqu'à maintenant. Souder sur le coin d'un bureau, fer électrique branché sur une multi-prise, ça va un moment. Mais niveau sécurité c'est assez moyen.

Bref, j'ai opté pour la conception d'une paillasse de laboratoire.
Elle est toute simple :
> Le plan de travail est réalisé en carrelage blanc
> Le courant électrique est distribué par des prises fixées à un caisson

A la base il y a une bête table en pin (1er prix Ikéa) !

Puis il faut couper, percer, clouer du mélaminé blanc.
Y fixer des prises un interrupteur et quelques câbles.
Se mettre au carrelage : sous-couche, colle, joints.

... et ça donne ça !


jeudi 28 janvier 2010

Test de stérilité (2) : innoculum

Un petit tour du côté des milieux de culture.

Il y a 2 semaines, j'ai testé un mode de repiquage stérile de bourgeons de ficus.
Le but n'est pas que des petits ficus se développent, mais plutôt :
- Que les bourgeons ne pourrissent pas, ce qui serait un signe de traitement des échantillons trop agressif
- Que le milieu de culture ne soit pas envahi de moisissures, ce qui indiquerait que l'environnement de repiquage (instruments, plan de travail) n'est pas correct

Le résultat est très encourageant : les bourgeons sont verts sans aucune trace de champignons contaminants !!
Et c'est bien la première fois que je parviens à ce résultat ! Les essais précédents (il y a longtemps), se soldaient par l'apparition en quelques jours de champignons sur les fragments végétaux, et un noircissement de ceux qui n'étaient pas contaminés.

Moralité :
- Les conditions de mise en culture (sur ... la gazinière ! avec du matériel stérilisé à l'eau bouillante) sont ok
- Les conditions de stérilisation des fragments végétaux ne les détruisent pas

Prochaine étape : passer de la gazinière à un vrai plan de travail !!
On verra ça en mars, car d'ici-là le temps va me manquer.





jeudi 14 janvier 2010

Test de stérilité (1) : milieu de culture



"Mais qu'est-ce que c'est ?" me direz-vous ?
Hé bien c'est le nouveau tournant du projet !! A savoir la culture in vitro des orchidées !
Rien que ça !

C'est un détour pour mieux revenir plus tard sur l'hydroponie.
Car il y a plusieurs avantages avec la culture en bocaux :
- Le milieu est solide, donc pas de régulation du pH, de la conductivité et du volume d'eau
- La taille de l'enceinte de culture : avec des contenants de 8 centimètres de diamètre, il est beaucoup plus simple d'étudier les conditions optimales de culture (pH, conductivité, température, etc) que dans des bacs de 40 x 30 cm et de 70 cm de haut !!!

Revenons à la photo.
La toute première étape consistait à vérifier qu'avec les "moyens de bord" il est possible d'obtenir des milieux de culture stériles.
15 jours après la préparation de bocaux stérilisés à l'eau bouillante, contenant une solution gélifiée d'engrais, il n'y a aucune pousse de moisissures. C'est donc stérile.
A plusieurs reprises, il y a longtemps, j'avais essayé sans succès : les moisissures apparaissaient après 3-4 jours. Donc je tiens le bon bout !

La suite :
> Préparer le plan de travail pour manipulations stériles
> Poursuivre la conception du logiciel de pilotage de la serre à bocaux
> Concevoir les premier périphériques de cette serre